Активность основных карбоксипептидаз в тканях мышей при введении тестостерона и прогестерона - диссертация

Ряд авторов отмечают тесную взаимосвязь между уровнями тестостерона, прогестерона и гормонами задней доли гипофиза (окситоцином, Arg⁸-вазопрессином и др.) [214, 266]. В частности тестостерон (в концентрации 0,01-0,1 мкг на мл), выступая в качестве предшественника 17-эстрадиола, увеличивает in vitro секрецию окситоцина гранулезными клетками яичников. При более высоких концентрациях наблюдается обратный эффект - ингибирование секреции [274]. Тестостерон влияет на экспрессию пролактина в дорсальной и латеральной простате [213] и может выступать в качестве стимулятора секреции пролактин-подобного пептида клетками яичников [245]. Этот гормон в некоторой степени ингибирует высвобождение Arg⁸-вазопрессина из гипоталамических срезов in vitro [175]. Окситоцин, Arg⁸-вазопрессин и Arg⁸-вазотоцин участвуют в регуляции секреции тестостерона и прогестерона [214]. Кроме того, имеются данные о том, что уменьшение рецепторов окситоцина при старении в обонятельных луковицах и гипоталамическом вентромедиальном ядре связано со снижением уровня тестостерона в плазме [56].

Тестостерон (в отличие от прогестерона) не оказывает влияния на аккумуляцию кальцитонин-ген-зависимого пептида ни в ядрах тройничного нерва, ни в шейном отделе позвоночника [208]. С другой стороны, по мнению авторов [208], факт наличия кальцитонин-ген-зависимого пептида в гипоталамусе только самцов, свидетельствует о положительном эффекте тестостерона.

На клеточном уровне тестостерон способствует увеличению (а прогестерон - уменьшению) зоны гранулярных микротрубочек в клетках подчелюстной железы крыс [90], играет ведущую роль в регуляции транспорта Ca²⁺ в клетках миометрия [252], стимулирует продукцию цАМФ в клетках яичников свиньи [244].

Тестостерон и другие андрогены в виде 5-редуцированных производных оказывают влияние на клетки ЦНС [200], вместе с прогестинами способствуя их дифференцировке на ранних этапах онтогенеза [193, 198]. При этом отмечается отсутствие половых различий в содержании мРНК андрогеновых рецепторов в латеральной перегородке, вентромедиальном ядре или аркуатном ядре [193]. Кроме того известно, что андрогены, регулируя ароматазную активность на уровне экспрессии гена в медиальной преоптической зоне и других компонентах мозга, опосредует половое поведение самцов. Так, для активации спаривания необходима ароматизация тестостерона в эстрадиол [233]. Это позволяет сделать предположение, что тестостерон и/или его эстрогенные метаболиты определяют в развивающемся мозге поло-специфичную способность к ароматизации. Они также вовлекаются в регулирование андрогенного ответа внутри компонентов нервной зоны, которые опосредуют половое поведение самцов [60, 166, 233].

Тестостерон способен оказывать влияние на синтез прогестерона in vitro [264].

1.3.2. Прогестерон

Прогестерон относится к прогестинам, или гестагенам (лат. gestatio - беременность), то есть к гормонам, благоприятствующим развитию беременности. По химическому строению принадлежит к прегнановой (С₂₁) группе.

Синтез и секреция прогестерона осуществляется желтым телом яичников под влиянием ЛГ. При беременности (после 6-8 недель) основным источником данного гормона становится плацента, продуцирующая на поздних стадиях в 30-40 раз больше прогестерона, чем желтое тело [32]. Кроме того, как известно, прогестерон является промежуточным продуктом при синтезе многих других стероидных гормонов (андрогенов, минералокортикоидов, глюкокортикоидов). Поэтому немаловажную роль в создании общего пула прогестерона в крови играют надпочечники. Здесь секреция прогестерона находится под контролем АКТГ [40]. В плазме крови значительная часть прогестерона связывается с транскортином (кортикостероид-связывающий белок, синтез которого осуществляется в печени), альбумином и оросомукоидом [32, 27]. Биологической активностью, как и в случае с тестостероном, обладает свободная (несвязанная) форма гормона. Количество прогестерона в плазме изменяется в широких пределах (у человека от 0,3 до 15 пг/мл [27]) и зависит от фазы эстрального цикла. Период полураспада прогестерона в плазме крови составляет 90-105 мин [42].

Некоторые исследователи [40] отмечают, что изменение уровня прогестерона в крови в течение эстрального цикла обусловлено секрецией прогестерона надпочечниками. Максимальная концентрация достигается после овуляции, а именно после спада овуляторной волны ЛГ. С другой стороны предполагают, что именно прогестерон надпочечников является стимулятором овуляторной волны ЛГ [40]. Необходимо отметить определенную взаимосвязь в синтезе надпочечниками прогестерона и других стероидов. В стадии проэструса, когда происходит выброс овуляторной волны ЛГ, концентрация глюкокортикоидов достигает своего максимального значения [40]. Известно также, что глюкокортикоиды повышают чувствительность яичников к гонадотропинам (ЛГ и ФСГ) как у взрослых, так и у неполовозрелых животных [40]. Кроме того, концентрация прогестерона в плазме крови изменяется в течение суток. Эти изменения в основном сопадают с циркадным ритмом кортикостерона [32, 40]. Подобное совпадение, по всей вероятности, обусловлено суточным ритмом высвобождения АКТГ [32]. С другой стороны, у сокола Falco cherrug обнаружена обратная взаимосвязь между уровнем прогестерона и кортикостерона в крови [47].

Прогестерон инактивируется в печени, где образует ряд соединений. Основной путь метаболизма - восстановление, с образованием прегнандиола [24, 32]. Через почки выводится, главным образом, в виде прегнандиол-20-глюкуронида натрия.

Главный физиологический эффект прогестерона заключается в подготовке эндометрия, путем разрыхления субгландулярной стромы, к имплантации бластоцита и создании благоприятных условий для его развития [24, 27, 39]. Кроме того, прогестерон расслабляет гладкую мускулатуру матки и понижает ее чувствительность к окситоцину [24, 27, 39]. Экзогенный прогестерон способствует увеличению уровня свободного холестерина в плазматических мембранах клеток, что вызывает изменение свойств последних (увеличивается вязкость, уменьшается проницаемость для ионов и молекул) [41]. Ткачева Н.Ю. объясняет данный эффект стимулирующим влиянием прогестерона на липогенез в печени и жировой ткани, повышением липопротеинлипазной активности, ингибированием липолиза, а также возможным участием в этом процессе инсулина (при введении прогестерона наблюдается повышение секреции инсулина) [41, 137]. Таким образом, действие прогестерона на жировую ткань противоположно эффекту тестостерона [67].

Прогестерон in vitro ингибирует секрецию катехоламина, вызванную ацетилхолином или никотином в клетках мозгового слоя надпочечников, возможно через блокаду притока Ca²⁺ [86]. In vitro этот гормон увеличивает содержание в олигодендроцитах основного миелинового пептида и циклонуклеотидфосфодиэстеразы [164]. Кроме этого, in vitro рассматриваемый половой стероид способен (в зависимости от дозы) снижать уровни мРНК рецепторов эстрадиола, андрогенов и своих собственных в клетках стромы эндометрия [162]. Он способен снижать продукцию тестостерона у эмбрионов (при этом увеличивается уровень циркулирующего ЛГ) [228]. Прогестерон стимулирует реинициацию, дальнейшее развитие и мейоз ооцитов in vitro [243]. Он также активирует продукцию цАМФ и цГМФ в клетках яичников свиньи [244] и ингибирует секрецию пролактин-подобного пептида клетками яичников [245]. Этот гормон ингибирует активность 5-редуктазы в коже гениталий [79]; повышает активность 11в-гидроксистероид-дегидрогеназы в норме и у адреноэктомированных крыс [218] и ингибирует активность N-деметилазы, участвующей в N-деметилировании этилморфина [127]. Прогестерон оказывает влияние и на иммунный ответ организма. В частности, контролирует способность макрофагов участвовать в иммунном ответе [204].

Прогестерон in vivo ингибирует продукцию окситоцина в гипофизе [32], но in vitro в физиологических дозах стимулирует секрецию этого пептида в фолликулах [274]. У самок, перед родами, увеличение уровня мРНК окситоцина в паравентрикулярном и супраоптическом ядрах гипоталамуса связано со спонтанным спадом уровня прогестерона. В то же время уровень мРНК Arg⁸-вазопрессина в этих отделах гипоталамуса не подвержен влиянию уменьшения уровня прогестерона [266].

Прогестерон вместе с эстрогенами препятствует началу лактации во время беременности, блокируя действие пролактина на молочные железы [39]. Рассматриваемый гормон увеличивает аккумуляцию кальцитонин-ген-зависимого пептида в ядрах троиничного нерва [208].

Прогестерон увеличивает как связывание, так и деградацию инсулина в гепатоцитах, причем увеличение деградации превышает увеличение связывания [167].

In vivo рассматриваемый гормон способствует снижению базального уровня интерлейкина-6 [52] и высвобождению интерлейкина-1 [174]. При этом in vitro уменьшает индуцированное интерлейкином-1 разрушение хрящей [88]. С другой стороны, интерлейкин-1в в культуре клеток гранулезы яичника крысы стимулирует деградацию прогестерона [99].

Эндогенный прогестерон играет определенную роль в контроле активности раковых новообразований [51, 70]. В частности, через свои ядерные рецепторы он регулирует рост и развитие рака груди [231], индуцирует дозозависимое увеличение уровня фактора роста сосудистого эндотелия и ”простатического специфического антигена” в клетках Т47-D рака груди [29, 157].

Прогестерон модулирует активность цистиновой аминопептидазы как у самок, так и у самцов [191].

Таким образом, факты, свидетельствующие о влиянии тестостерона и прогестерона на функционирование пептидергических систем [2, 67, 167, 175, 213, 214, 245, 274, 266, 277 и др.], а также на активность некоторых протеолитических ферментов [24, 67, 127, 191 и др.], позволяют предположить, что эти половые стероиды могут участвовать в регуляции обмена нейропептидов. В связи с этим представляет интерес изучение активности ферментов обмена нейропептидов: КП Н и ФМСФ-ингибируемой КП при введении тестостерона и прогестерона.

Гонады (семенники и яичники) являются основными источниками половых стероидов в организме. Регуляция функции половых желез происходит под влиянием гормонов аденогипофиза - фоллитропина (фолликулостимулирующий гормон, ФСГ) и лютропина (лютеинизирующий гормон, ЛГ) [24, 27, 32, 39, 42]. Первый осуществляет морфофункциональную регуляцию, то есть усиливает деятельность клеток Сертоли (в семенниках) и активирует развитие фолликулов (в яичниках), что способствует выработке сперматозоидов и яйцеклеток. ЛГ ответственен непосредственно за выработку мужских и женских половых гормонов: андрогенов, эстрогенов и прогестинов [27, 32]. В то же время, синтез ФСГ и ЛГ контролируется гонадотропин-рилизинг-фактором (ГнРФ). Секреция последнего регулируется по принципу длинной (половые гормоны ингибируют секрецию ГнРФ), короткой (ингибиторное влияние гонадотропинов) и ультракороткой (гонадотропин-рилизинг фактор ингибирует свою собственную секрецию) обратной связи [27, 32, 63, 145]. Поэтому гипоталамус, гипофиз и половые железы объединяют в одну систему - гипоталамо-гипофизарно-гонадную (ГГГС) [24, 27, 39, 42].

С другой стороны, в надпочечниках также синтезируются тестостерон и прогестерон [27, 32]. Синтез стероидных гормонов надпочечников находится под влиянием кортикотропина. Следует отметить, что АКТГ стимулирует синтез не только кортикостероидов, но и половых гормонов [40, 32]. Секреция АКТГ, в свою очередь, зависит от синтеза кортиколиберина - рилизинг фактора гипоталамуса [27, 32, 39]. Принцип регуляции синтеза и секреции этого нейрогормона такой же, как и в случае ГнРФ, то есть половые гормоны, гонадотропины и сам АКТГ ингибируют высвобождение этого нейрогормона [24, 32, 39]. Поэтому гипоталамус, гипофиз и надпочечники объединяют в гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковую систему (ГГНС) [24, 27, 42].

Таким образом, при исследовании влияния половых гормонов, ГГГС и ГГНС можно рассматривать как единую гипоталамо-гипофизарно-надпочечниково-гонадную систему (ГГНГС).

Следует также отметить, что в гипофизе и гипоталамусе обнаружена высокая активность КП Н, а в надпочечниках и половых железах - высокая активность ФМСФ-ингибируемой КП у многих видов животных [12, 44, 45, 81, 117, 122, 165, 180, 222, 225, 256, 262 и др.]. Именно поэтому активность ферментов определяли в гипоталамусе, гипофизе, надпочечниках и половых железах самцов и самок мышей.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Материал исследования

Опыты проводили на самках и самцах белых беспородных мышей в возрасте 90-100 дней. Использовали следующие препараты половых стероидных гормонов: пропионат тестостерона (АО ”Эмпилс” завод ”Фармадон”, г. Ростов-на-Дону), прогестерон (АО ”Эмпилс” завод ”Фармадон”, г. Ростов-на-Дону), а также оливковое масло. В качестве специфических ингибиторов применяли ФМСФ (Serva”, США) и ГЭМЯК (“Serva”, США). Все остальные реактивы были отечественного производства с квалификацией ”ХЧ” и ”ОСЧ”.

2.2. Методы исследования

2.2.1. Метод введения половых стероидных гормонов

При изучении влияния половых гормонов на КП Н и ФМСФ-ингибируемую карбоксипептидазу in vivo все препараты вводились внутрибрюшинно в виде растворов в оливковом масле. Вводимый объем был равен 0,1 мл. Дозы половых гормонов были следующими: 1) 3 и 30 мг на кг массы в случае пропионата тестостерона; 2) 1 и 10 мг на кг массы в случае прогестерона. Контрольным животным вводили равный объем оливкового масла. В работе использовали следующие группы животных.

Животных декапитировали через 0,5, 4 и 24 часа после инъекции. Затем извлекали головной мозг, половые железы, надпочечники и помещали их в охлажденный до 4^оС физиологический раствор (0,9% раствор хлорида натрия в воде). Все дальнейшие процедуры, если не оговорено иначе, проводили при 4^оС.

Головной мозг тщательно очищали от оболочек, кровеносных сосудов и извлекали гипофиз и гипоталaмус.

Яичники и надпочечники тщательно очищали от жира.

Образцы тканей хранили при температуре -20^оС не более одного месяца до использования.

Для исследования влияния половых гормонов на КП Н и ФМСФ-ингибируемую карбоксипептидазу in vitro гомогенаты тканей инкубировали с гормонами или оливковым маслом в течение 60 мин при 4^оС. Концентрации гормонов соответствовали дозам при введении in vivo. Затем определяли активность ферментов как описано ниже.

Для определения активности ферментов образцы тканей взвешивали, а затем гомогенизировали в 50 мМ натрий-ацетатном буфере (pH 5,6), содержащем 50 мМ хлорида натрия в соотношении 1:400 (вес:объем).

2.2.1. Метод определения активности карбоксипептидазы Н

Активность КП Н определяли флюорометрическим методом по Supattapone S., Fricker L.D., Snyder S.H. [262].

Для определения активности фермента смешивали 150 мкл (в случае контрольной пробы) или 140 мкл (в случае опытной пробы) вышеуказанного буфера с 50 мкл гомогената ткани. Опытные пробы содержали 1 мкМ ГЭМЯК. Пробы преинкубировались 8 мин при 37^оС.

Реакцию начинали прибавлением 50 мкл 210 мкМ дансил-Phe-Ala-Arg на 50 мМ натрий-ацетатном буфере, pH 5,6 (конечная концентрация в реакционной смеси составляла 42 мкМ). Далее пробы инкубировали 60 мин при 37^оС. Реакцию останавливали прибавлением 50 мкл 1М раствора соляной кислоты. Для экстракции продукта реакции - дансил-Phe-Ala - к пробам приливали 1,5 мл хлороформа и встряхивали в течение 60 сек. Для разделения фаз пробы центрифугировали 5 мин при 1000 g. Измерение флюоресценции хлороформной фазы проводили на флюориметре ФМЦ-2 в кювете толщиной 1 см при _ex=360 нм и _em=530 нм. В качестве стандарта использовали 1 мкМ раствор дансил-Phe-Ala в хлороформе.

Активность КП Н определяли как разность в накоплении продукта реакции в пробах, несодержащих и содержащих ГЭМЯК, и выражали в нмоль дансил-Phe-Ala образовавшегося за 1 мин инкубации в пересчете на 1 мг белка.

2.2.2. Метод определения активности ФМСФ-ингибируемой карбоксипептидазы

Активность ФМСФ-ингибируемой карбоксипептидазы определяли флюориметрическим методом [7, 11]. К 150 мкл, в случае контрольной пробы, и к 140 мкл, в случае опытной пробы, вышеуказанного буфера прибавляли по 50 мкл гомогената.

В опытную пробу добавляли 10 мкл 25 мМ раствора ФМСФ, приготовленного на этиловом спирте (конечная концентрация ФМСФ в реакционной смеси составляла 1 мМ).

Дальнейшее определение активности ФМСФ-ингибируемой карбоксипептидазы проводилось так же, как и для КП Н, с той лишь разницей, что вместо дансил-Phe-Ala-Arg в качестве субстрата использовали 50 мкл 210 мкМ дансил-Phe-Leu-Arg на 50 мМ натрий-ацетатном буфере, pH 5,6.

Активность фермента определяли как разность в накоплении продукта дансил-Phe-Leu в пробах, несодержащих и содержащих ФМСФ. Активность выражали в нмоль дансил-Phe-Leu образовавшегося за 1 мин инкубации в пересчете на 1 мг белка.

2.2.3. Метод определения концентрации белка

Количество белка в пробах определяли по методу Lowry и соавт. [179].

2.2.4. Статистическая обработка результатов исследования

Достоверность отличий между средними определяли с использованием t-критерия Стьюдента [31]. Корреляционный и дисперсионный анализы проводили с помощью программы Statgraphics (версия 3.0) (“STSC, Inc.” США) в режимах Simple Correlation, One-Way ANOVA и Multifactor ANOVA. Принадлежность подгрупп животных к разным гомогенным группам оценивали с помощью Multiple range analysis (Statgraphics (версия 3.0) (“STSC, Inc.” США)). Принадлежность экспериментальных (временных) подгрупп к разным гомогенным группам проводили только в случае достоверности критерия Фишера. При этом оценивали количество гомогенных групп, образуемых экспериментальными подгруппами, с уровнем достоверности р<0,05. Баллы подгруппам присваивали на основании их принадлежности к разным гомогенным группам по мере увеличения среднего. При этом минимальный балл получала временная подгруппа с минимальным средним, максимальный балл - временная подгруппа с максимальным средним, а дробный балл (1,5) получали подгруппы, входящие одновременно в две гомогенные группы. На основании присвоеных баллов судили о динамике изменения активности ферментов.

ГЛАВА 3. Результаты исследования

3.1. Тканевое распределение активности основных карбоксипептидаз у самцов и самок мышей

3.1.1. Распределение активности карбоксипептидазы Н в гипоталамо-гипофизарно-надпочечниково-гонадной системе самцов и самок мышей

Полученные данные о распределении активности КП Н в ГГНГС самцов и самок мышей представлены в таблице 3.1.1.

Таблица 3.1.1. Распределение активности (нмоль дансил-Phe-Ala в мин на мг белка) КП Н у самцов и самок мышей (n=58).

Максимальная активность фермента у самцов обнаружена в гипофизе. В гипоталамусе активность была примерно в 2 раза ниже, а в надпочечниках и семенниках - в 9-15 раз ниже, чем в гипофизе.

У самок в порядке снижения активности КП Н ткани можно расположить следующим образом: гипофиз (максимальная активность), гипоталамус (активность, примерно, в 2,5 раза ниже), надпочечники, яичники (минимальная активность). Таким образом, распределение активности КП Н в ГГНГС мышей сходно с таковым у других видов животных [12, 44, 117, 122, 165, 182, 256, 262]. Однако обнаружены некоторые отличия между распределением активности КП Н у мышей разного пола. У самцов разница между активностью этого фермента в надпочечниках и таковой в гонадах составляет, примерно, 67%, а у самок - только 35%. У самок активность КП Н, в целом, примерно в 3,3 раза выше, чем у самцов.

3.1.2. Распределение активности ФМСФ-ингибируемой карбоксипептидазы в в гипоталамо-гипофизарно-надпочечниково-гонадной системе самцов и самок мышей

Полученные данные о распределении активности ФМСФ-ингибируемой КП у самцов и самок мышей представлены в таблице 3.1.2.

Таблица 3.1.2. Распределение активности (нмоль дансил-Phe-Leu в мин на мг белка) ФМСФ-ингибируемой КП у самцов и самок мышей (n=58).

У самцов максимальная активность исследуемого фермента обнаружена в надпочечниках. В гипофизе и семенниках активность ФМСФ-ингибируемой КП примерно в 2 раза, а в гипоталамусе - в 5 раз ниже, чем в надпочечниках.

У самок распределение активности этого фермента несколько отличается от такового у самцов. Наивысшие показатели активности были отмечены в яичниках и надпочечниках (в последних на 15% ниже, чем в первых). Минимальная активность ФМСФ-ингибируемой КП, также как и у самцов, обнаружена в гипоталамусе.

Таким образом, как у самцов, так и у самок, наиболее высокие показатели активности ФМСФ-ингибируемой КП в ГГНГС обнаружены в надпочечниках и половых железах - основных источниках половых стероидов в организме. У самцов активность ФМСФ-ингибируемой КП в надпочечниках на 127% выше, чем в семенниках; у самок в надпочечниках - на 15% ниже, чем в яичниках. У самок активность ФМСФ-ингибируемой КП в гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой системе примерно в 4,5 раза выше, чем у самцов.

Следует также отметить, что распределение активности ФМСФ-ингибируемой КП в тканях мышей сходно с таковым у других видов животных [8, 13, 12, 44, 45].

Таким образом, сравнивая распределение активности двух основных карбоксипептидаз в ГГНГС, можно заключить, что если активность КП Н и у самцов, и у самок, максимальна в гипофизе и гипоталамусе, то активность ФМСФ-ингибируемой КП - в надпочечниках и половых железах. Возможно, это связано с разной функциональной ролью данных ферментов в различных отделах ГГНС и ГГГС.

3.2. Активность основных карбоксипептидаз у самок мышей при введении тестостерона и прогестерона

Известно, что тестостерон и прогестерон оказывают влияние на уровень различных пептидных нейрогормонов в организме животных [67, 167, 175, 213, 214, 245, 266, 274], а также на активность некоторых протеолитических ферментов [24, 67, 127, 191] . В связи с этим представляет интерес изучение влияния данных половых стероидов на активность ферментов обмена нейропептидов: КП Н и ФМСФ-ингибируемой КП.

3.2.1. Активность карбоксипетидазы Н и ФМСФ-ингибируемой карбоксипептидазы при введении тестостерона в тканях самок мышей

Активность КП Н в гипофизе через 0,5 ч после введения тестостерона в дозе 3 мг на кг массы была выше на 61%, по сравнению с контрольной группой животных (рис. 3.2.1). Через 24 ч после введения тестостерона активность исследуемого фермента в гипофизе была на 16%, а в гипоталамусе и надпочечниках - на 45-50% ниже, чем у контрольных животных. В яичниках достоверных изменений активности КП Н не обнаружено. Снижение активности фермента в гипофизе и гипоталамусе через 24 ч после инъекции тестостерона в дозе 3 мг на кг массы может быть связано с тем, что экзогенный тестостерон подавляет выработку эндогенного тестостерона по механизму обратной связи посредством снижения уровня синтеза и секреции ЛГ и гонадотропин-рилизинг фактора [202]. Период полужизни экзогенного тестостерона составляет 40-100 мин [42, 192], то есть через 24 ч после введения экзогенный тестостерон полностью элиминируется, тогда как выработка эндогенного еще может быть подавлена. Это, вероятно, может приводить к снижению биосинтеза нейропептидов и к снижению активности КП H.

Активность КП Н у самок, которым вводили тестостерон в дозе 30 мг на кг массы, была ниже таковой у контрольных мышей в гипофизе и надпочечниках через 24 ч - на 29% и 55% соответственно (рис. 3.2.2). Через 0,5 и 4 ч после инъекции тестостерона в этих органах достоверных изменений активности КП Н не выявлено. В гипоталамусе активность этого фермента изменялась волнообразно: через 0,5 ч после введения активность была ниже на 36%, через 4 ч - на 22% выше, а через 24 ч - вновь ниже на 53%, по сравнению с контрольными животными. Только в этом отделе ГГНГС отмечено достоверное отличие во влиянии разных доз тестостерона. В яичниках активность КП Н достоверно не изменялась при введении тестостерона в дозе 30 мг на кг массы.

Для более полного понимания характера выявленных изменений активности основных карбоксипептидаз первичный экспериментальный материал бы подвергнут дисперсионному анализу влияния времени после инъекции при введении различных доз тестостерона (таблицы 3.2.1.1. и 3.2.1.2).

Статистически значимая динамика активности КП Н наблюдается только в гипоталамусе в случае введения тестостерона в дозе 30 мг на кг массы (таблица 3.2.1.2).

Дисперсионный анализ влияния времени и дозы гормона (таблица 3.2.1.3) показал отсутствие достоверной зависимости активности КП Н от дозы экзогенного тестостерона в исследованном диапазоне доз. Только в гипоталамусе обнаружено влияние взаимодействия времени после инъекции и дозы вводимого гормона на активность исследуемого фермента.

Таким образом, при введении различных доз тестостерона существенных отличий в активности КП Н у самок не обнаружено.

В гипофизе активность ФМСФ-ингибируемой КП после введения тестостерона (доза 3 мг на кг массы) через 0,5, 4 и 24 ч была ниже соответственно на 28, 61 и 59%, по сравнению с контролем (рис. 3.2.3). В гипоталамусе через 0,5 ч после введения активность исследуемого фермента не изменялась, а через 4 и 24 ч была на 35-40% ниже, чем у контрольных животных. В надпочечниках изменения в активности ФМСФ-ингибируемой КП отмечены только через 24 ч: повышение на 14% по сравнению с контрольными самками. В яичниках активность фермента через 0,5 и 24 ч была соответственно на 21 и 49% ниже, по сравнению с контролем.

Влияние тестостерона в дозе 30 мг на кг массы, в целом, сходно с таковым в дозе 3 мг на кг массы (рис. 3.2.4). При этом в гипофизе активность ФМСФ-ингибируемой КП во все исследуемые временные интервалы была ниже, по отношению к контрольным самкам (через 0,5 ч - на 39%, через 4 и 24 ч - на 62-68%). В гипоталамусе через 0,5 ч после инъекции активность этого фермента не отличалась от таковой у контрольных животных, а через 4 и 24 ч - была ниже на 35-40%. В надпочечниках изменений активности ФМСФ-ингибируемой КП не обнаружено. В яичниках достоверное изменение активности отмечено только через 24 ч послее введения тестостерона в дозе 30 мг на кг массы: снижение на 30% по отношению к контролю.

Дисперсионный анализ влияния времени после инъекции при введении различных доз тестостерона на активность ФМСФ-ингибируемой КП (таблицы 3.2.1.1. и 3.2.1.2) показал, что статистически значимая динамика изменения активности фермента наблюдается в гипофизе, гипоталамусе и яичниках. Причем динамика изменений активности фермента в этих отделах ГГНГС одинаковая - повышение активности ФМСФ-ингибируемой КП к 0,5 ч и снижение к 4 ч. В интервале 4-24 ч активность ФМСФ-ингибируемой КП статистически достоверно не изменялась.

Дисперсионный анализ влияния времени и дозы гормона (таблица 3.2.1.3) показал отсутствие зависимости активности ФМСФ-ингибируемой КП от дозы экзогенного тестостерона в исследованном диапозоне доз, а также от взаимодействия дозы и времени после введения.

Таким образом, как и в случае с КП Н, не обнаружено существенных отличий во влиянии различных доз тестостерона (3 и 30 мг на кг массы) на активность ФМСФ-ингибируемой КП.

Известно, что in vitro тестостерон в концентрации 0,01 и 0,1 мкг на мл увеличивает секрецию окситоцина клетками гранулезы яичников на 75 и 100% соответственно. Более высокая концентрация (10 мкг на мл) - ингибирует на 66% [274]. Таким образом, отличия в действии проявляются при разнице между дозами в 100-1000 раз. С другой стороны, дозы тестостерона, различающиеся в 5 раз (5 и 25 мкг), одинаково влияли на индекс веса тимуса у новорожденных самок мышей [110]. В настоящем исследовании дозы отличались между собой в 10 раз. Возможно, именно поэтому существенных отличий в изменении активности КП Н и ФМСФ-ингибируемой КП при введении тестостерона не выявлено.

В изменении активности КП Н и ФМСФ-ингибируемой КП обнаружены некоторые отличия при действии тестостерона в дозе 3 мг на кг массы. В гипофизе через 0,5 ч после инъекции мужского полового гормона активность КП Н возрастала, а активность ФМСФ-ингибируемой КП, наоборот, снижалась. С другой стороны, через 24 ч после введения в надпочечниках активность ФМСФ-ингибируемой КП повышалась, а КП Н - снижалась. Поскольку КП Н и ФМСФ-ингибируемая КП отличаются субстратной специфичностью [11, 147, 148], то возможно, подобное различие в изменении активности связано с участием исследуемых карбоксипептидаз в процессинге разных биологически активных пептидов, уровень которых в гипофизе и надпочечниках по-разному изменяется при введении тестостерона или прогестерона.

3.2.2. Активность карбоксипетидазы Н и ФМСФ-ингибируемой карбоксипептидазы при введении прогестерона в тканях самок мышей

При введении прогестерона в дозе 1 мг на кг массы через 0,5 ч во всех отделах ГГНГС достоверных изменений активности КП Н не обнаружено (рис. 3.2.5). Через 4 ч после введения прогестерона только в гипофизе и яичниках наблюдалось достоверное изменение активности фермента - повышение, примерно, в 2 раза, по сравнению с контролем. Через 24 ч прогестерон в надпочечниках и гипоталамусе достоверно снижал активность КП Н соответственно в 1,8 и 2,3 раза, по сравнению с контролем. В других отделах ГГНГС в данном временном интервале (24 ч) активность КП Н достоверно не отличалась от таковой у контрольных самок.

Прогестерон в дозе 10 мг на кг массы в гипофизе через 0,5 и 4 ч вызывал достоверное повышение активности КП Н примерно в 1,9 раза, а через 24 ч - снижение в 1,7 раза (рис. 3.2.6). В гипоталамусе в начальный период времени (0,5-4 ч) достоверное изменение активности исследуемого фермента не выявлено. Через 24 ч активность КП Н по сравнению с контролем была ниже в 2,9 раза,. В надпочечниках прогестерон в дозе 10 мг на кг массы снижал активность КП Н через 0,5 и 24 ч примерно на 40%. При этом через 4 ч после введения активность фермента не отличалась от контроля. В яичниках достоверное изменение активности КП Н было обнаружено только в двух случаях: через 4 ч - активность фермента была выше в 2,3 раза, а через 24 ч - ниже в 5,6 раза, чем у контрольных животных.

Дисперсионный анализ влияния времени после введения различных доз прогестерона (1 и 10 мг на кг массы) на активность исследуемых ферментов представлен в таблицах 3.2.2.1 и 3.2.2.2. Активность КП Н в гипоталамусе постепенно снижалась к 24 ч после введения прогестерона в дозе 1 мг на кг массы. При этом в гипофизе наблюдалась колоколообразная динамика: повышение к 4 ч и снижение к 24 ч до уровня 0,5 ч. В яичниках и надпочечниках достоверного влияния времени после введения прогестерона в дозе 1 мг на кг массы на активность КП Н не выявлено. После введения более высокой дозы прогестерона (10 мг на кг массы) (таблица 3.2.2.2) в гипоталамусе и гипофизе активность исследуемого фермента не изменялась в интервале 0,5-4 ч, а затем снижалась к 24 ч. В яичниках наблюдалось повышение к 4 ч и снижение к 24 ч.

Дисперсионный анализ влияния времени после инъекции и дозы гормона (таблица 3.2.2.3) показал отсутствие статистически значимой зависимости активности КП Н от дозы экзогенного прогестерона (за исключением активности в надпочечниках). Известно, что КП Н участвует в процессинге энкефалинов, высокий уровень которых обнаружен в надпочечниках [122, 147, 151]. Кроме того, в надпочечниках обнаружено высокое содержание прогестерона [40]. Возможно, что через изменение активности КП Н прогестерон регулирует уровень активных форм энкефалинов.

Таким образом, при увеличении концентрации экзогенного прогестерона в 10 раз характер и сила воздействия, практически, не изменяются.

Следует отметить, если в гипофизе самок при введении тестостерона в дозе 3 мг на кг массы активность КП Н увеличивается через 0,5 ч после инъекции, то при введении прогестерона в дозе 1 мг на кг массы - только через 4 ч. Известно, что прогестерон в организме служит предшественником тестостерона [199]. Возможно, влияние прогестерона опосредуется преврещением в тестостерон. Вероятно, именно поэтому действие прогестерона на активность КП Н в гипофизе проявляется через больший промежуток времени по сравнению с влиянием тестостерона.

Экзогенный прогестерон (доза 1 мг на кг массы) вызывал
снижение активности ФМСФ-ингибируемой КП в гипофизе через 0,5 ч на 31%, а через 24 ч - в 4,2 раза (рис. 3.2.7). Через 4 ч после введения прогестерона достоверных отличий в активности ФМСФ-ингибируемой КП от контроля не обнаружено. В гипоталамусе через 0,5 ч активность исследуемого фермента не отличалась от таковой у контрольных самок, а через 4 и 24 ч была ниже на 30-33%. В надпочечниках изменений в активности ФМСФ-ингибируемой КП не обнаружено. В яичниках только через 24 ч наблюдалось достоверное снижение активности этого фермента в 2,3 раза по сравнению с контролем.

Активность ФМСФ-ингибируемой КП при введении прогестерона в дозе 10 мг на кг массы (рис. 3.2.8) через 0,5 ч снижалась только в гипофизе (на 30%), а через 24 ч - в гипофизе, гипоталамусе и яичниках на 74, 40 и 43% соответственно по отношению к контролю. Необходимо отметить, что сходные изменения активности ФМСФ-ингибируемой КП наблюдались и при введении прогестерона в дозе 1 мг на кг массы (рис. 3.2.7). В остальных случаях статистически значимых отличий в активности ФМСФ-ингибируемой КП от контроля не обнаружено.

Результаты дисперсионного анализа влияния времени после введения прогестерона на активность ФМСФ-ингибируемой КП приведены в таблицах 3.2.2.1 и 3.2.2.2. Активность ФМСФ-ингибируемой КП при введении прогестерона в дозе 1 мг на кг массы в яичниках и надпочечниках постепенно снижалась к 24 ч. В гипоталамусе активность фермента снижалась к 4 ч, после чего не изменялась вплоть до 24 ч. В гипофизе активность исследуемого фермента не изменялась в интервале 0,5-4 ч, а затем снижалась к 24 ч. После введения прогестерона в дозе 10 мг на кг массы активность ФМСФ-ингибируемой КП в гипоталамусе и надпочечниках снижалась к 4 ч и не изменялась до 24 ч. В яичниках происходило постепенное снижение активности фермента к 24 ч.

В гипофизе активность ФМСФ-ингибируемой КП не изменялась в интервале 0,5-4 ч, а затем снижалась к 24 ч.

В гипоталамусе самок при введении как тестостерона (в дозах 3 и 30 мг на кг массы), так и прогестерона (в дозах 1 и 10 мг на кг массы), динамика изменения активности ФМСФ-ингибируемой КП одинакова: снижение в интервале 0,5-4 ч и далее отсутствие изменений до 24 ч. В надпочечниках время после инъекции тестостерона в дозе 3 мг на кг массы не влияет на активность исследуемой карбоксипептидазы. Прогестерон в дозе 1 мг на кг массы вызывал плавное снижение активности фермента в интервале 0,5-24 ч. После введения высоких доз половых стероидных гормонов (30 мг на кг массы тестостерона и 10 мг на кг массы прогестерона) динамика изменения активности ФМСФ-ингибируемой КП в этом отделе ГГНГС была одинаковой: снижение активности к 4 ч и отсутствие изменений через 24 ч. В гипофизе и яичниках после введения тестостерона (как высокой, так и низкой дозы) активность ФМСФ-ингибируемой КП снижалась к 4 ч и не изменялась до 24 ч. После инъекций обеих доз прогестерона в гипофизе активность не изменялась в интервале 0,5-4 ч и снижалась к 24 ч, а в яичниках происходило постепенное снижение активности фермента в промежутке от 0,5 до 24 ч.

Согласно результатам дисперсионного анализа (таблица 3.2.2.3) доза прогестерона, а также взаимодействие дозы и времени после инъекции, не влияют на активность ФМСФ-ингибируемой КП в ГГНГС самок мышей.

Таким образом, как и при введении тестостерона активность КП Н и ФМСФ-ингибируемой КП в ГГНГС самок мышей не зависит от дозы вводимого гормона (в исследованном диапозоне доз).

Необходимо отметить, что действие прогестерона на активность двух исследуемых карбоксипептидаз отличается. После введениия прогестерона в дозе 1 мг на кг массы в гипоталамусе активность КП Н оставалась неизменной в интервале 0,5-4 ч, затем снижалась к 24 ч, а активность ФМСФ-ингибируемой КП снижалась к 4 ч и далее не изменялась до 24 ч. В гипофизе активность ФМСФ-ингибируемой КП плавно уменьшалась к 24 ч, тогда как активность КП Н возрастала через 4 ч после инъекции. В надпочечниках и яичниках происходило постепенное снижение активности ФМСФ-ингибируемой КП к 24 ч. Статистически достоверной зависимости активности КП Н от времени после инъекции гормона не установлено. После введения прогестерона в дозе 10 мг на кг массы в гипофизе динамика изменения активности обеих карбоксипептидаз одинакова: неизменность в интервале 0,5-4 ч и снижение к 24 ч. В гипоталамусе активность КП Н была постоянной в итервале 0,5-4 ч и снижается к 24 ч, а активность ФМСФ-ингибируемой КП снижалась к 4 ч и оставалась на этом уровне до 24 ч. В яичниках активность КП Н повышалась к 4 ч, затем снижалась к 24 ч, а активность ФМСФ-ингибируемой КП постепенно снижалась к 24 ч.

Таким образом, активность обеих исследуемых карбоксипептидаз как в случае тестостерона, так и в случае прогестерона, практически не зависела от дозы вводимого полового гормона (в исследованном диапозоне доз).

3.3. Активность основных карбоксипептидаз у самцов мышей при введении тестостерона и прогестерона

В связи с отсутствием зависимости изменения активности КП Н и ФМСФ-ингибируемой КП от дозы вводимого гормона у самок, у самцов активность ферментов исследовалась только при введении тестостерона в дозе 3 мг на кг массы и прогестерона в дозе 1 мг на кг массы.

3.3.1. Активность карбоксипетидазы Н и ФМСФ-ингибируемой карбоксипептидазы при введении тестостерона в тканях самцов мышей

Результаты исследования активности КП Н в ГГНГС самцов при введении тестостерона в дозе 3 мг на кг массы представлены на рис. 3.3.1. Через 0,5 и 4 ч после инъекции активность фермента в гипофизе по сравнению с контрольными самцами была ниже примерно на 40%. В гипоталамусе и надпочечниках на все исследованные временные интервалы активность КП Н не отличалась от контроля. В семенниках активность исследуемой карбоксипептидазы через 4 ч была в 1,9 раза выше, а через 0,5 и 24 ч не отличалась от таковой у контрольных животных.

Данные об изменении активности ФМСФ-ингибируемой КП при введении тестостерона в дозе 3 мг на кг массы представлены на рис. 3.3.2. По сравнению с контрольной группой, статистически достоверное увеличение активности ФМСФ-ингибируемой КП обнаружено только в гипофизе (на 21%) через 24 ч. В остальных отделах ГГНГС самцов изменений активности ФМСФ-ингибируемой КП не выявлено.

Таким образом, при введении тестостерона в дозе 3 мг на кг массы в гипофизе самцов активность КП Н снижалась в начальный период времени (0,5-4 ч), в то время как активность ФМСФ-ингибируемой КП повышалась через 24 ч.

3.3.2. Активность карбоксипетидазы Н и ФМСФ-ингибируемой карбоксипептидазы при введении прогестерона в тканях самцов мышей

При введении прогестерона в дозе 1 мг на кг массы, в гипофизе через 0,5 ч активность КП Н была на 25% ниже, чем у контрольных самцов (рис. 3.3.3). В остальных отделах ГГНГС самцов изменений активности этого фермента не обнаружено.

У самцов, которым вводили прогестерон, активность КП Н в семенниках через 0,5 ч была в 3,3 раза выше, а через 4 и 24 ч - в 1,5-2 раза ниже, чем у животных, которым вводили тестостерон в дозе 3 мг на кг массы (рис. 3.3.3). В остальных отделах ГГНГС самцов отличий между активностью КП Н после введении тестостерона или прогестерона не обнаружено.

Прогестерон достоверно увеличивал активность ФМСФ-ингибируемой КП по отношению к контрольным животным в надпочечниках через 0,5 ч на 28%, а в семенниках - через 0,5 и 4 ч после инъекции, примерно, на 40% (рис. 3.3.4).

После введения прогестерона в гипоталамусе, гипофизе и надпочечниках влияния времени после инъекции на активность как КП Н, так и ФМСФ-ингибируемой КП не обнаружено (таблица 3.3.1). В семенниках время после инъекции достоверно влияло на активность КП Н: активность плавно снижалась к 24 ч.

Достоверной зависимости активности КП Н и ФМСФ-ингибируемой КП от времени после введении тестостерона во всех отделах ГГНГС самцов не обнаружено (таблица 3.3.1).

3.4. Активность карбоксипетидазы Н и ФМСФ-ингибируемой карбоксипептидазы in vitro при действии тестостерона и прогестерона

Для выяснения механизма действия тестостерона и прогестерона на активность основных карбоксипептидаз в ГГНГС мышей in vivo было исследовано влияние данных половых стероидов in vitro (таблица 3.4).

Исходя из полученных данных можно сделать вывод, что ни один из гормонов не влияет на активность исследуемых ферментов. Другими словами, прямое влияние тестостерона или прогестерона на молекулы КП Н и ФМСФ-ингибируемой КП, по-видимому, исключено.

Вместе с тем, в опытах in vivo активность обоих ферментов изменялась при введении гормонов. Следовательно, влияние тестостерона и прогестерона in vivo на активность КП Н и ФМСФ-ингибируемой КП опосредуется какими-то внутриклеточными механизмами.

Сопоставление результатов дисперсионного анализа влияния времени после введения у самцов и самок (таблица 3.5.1) позволяет заключить, что тестостерон не влияет на динамику активности КП Н ни у самцов, ни у самок. В то же время, во влиянии прогестерона на активность КП Н в половых железах выявлены отличия: в яичниках гормон не влиял на динамику изменения активности, а в семенниках наблюдалось плавное снижение активности КП Н. Следует отметить, что в надпочечниках ни одно из вводимых веществ достоверно не влияло на динамику активности КП Н у животных обоего пола.

Результаты дисперсионного анализа влияния времени на активность ФМСФ-ингибируемой КП в тканях самцов и самок при введении различных веществ представлены в таблице 3.5.2. Достоверного влияния времени на активность ФМСФ-ингибируемой КП ни в одном отделе ГГНГС самцов не обнаружено.

С другой стороны, практически во всех изученных случаях наблюдается статистически значимая временная динамика активности ФМСФ-ингибируемой КП в тканях самок (таблица 3.5.2). При введении оливкового масла во всех отделах ГГНГС, исключая гипофиз, наблюдается повышение активности фермента к 0,5 ч и снижение к 4 ч. В интервале 4-24 ч активность ФМСФ-ингибируемой КП не изменялась. При введении оливкового масла активность исследуемого фермента была постоянной в интервале 0,5-24 ч. Оба половых гормона влияли на динамику активности исследуемого фермента в гипофизе, по сравнению с таковой при введении оливкового масла. После инъекции тестостерона активность повышалась к 0,5 ч, затем снижалась к 4 ч и не изменялась в интервале 4-24 ч. В тоже время, активность ФМСФ-ингибируемой КП после введения прогестерона не изменялась в интервале 0,5-4 ч и снижалась к 24 ч.

Следует также отметить, что в случае введения прогестерона в яичниках происходило плавное снижение активности ФМСФ-ингибируемой КП к 24 ч, тогда как в случае введения оливкового масла снижение наблюдалось уже к 4 ч.

Сопоставление результатов влияния тестостерона в дозе 3 мг на кг массы и прогестерона в дозе 1 мг на кг массы в ГГНГС самцов и самок мышей позволяет выделить следующие особенности.

При введении прогестерона активность КП Н в семенниках и активность ФМСФ-ингибируемой КП в яичниках изменялись сходным образом: плавное снижение к 24 ч (та ...........